实验方法

1. 实验分组

所有大鼠驯化1周后，随机分为4组（n=10）：

①正常对照组（Con）：正常饲料+蒸馏水；

②模型组（Mod）：高脂饲料+蒸馏水；

③AE 50组：高脂饲料+蒸馏水+50mg/kg AE；

④AE100组：高脂饲料+蒸馏水+100mg/kg AE；

2. 检测与分析

①血清生化检测及组织形态学检查

生化试剂盒检测血清TC、TG、LDL-c、HDL-c水平; 采用苏木精-伊红（H&E）染色法，在数字显微镜下观察肝组织的组织形态学结构。

②LC-MS前处理

尿液样本在冰上解冻，在4℃11750g下离心10分钟，以除去所有沉淀物。转移200μL上清液到新试管中，并用1400μL去离子水稀释。旋涡10s后，将稀释后的尿液溶液在4℃11750g下离心10min，上清液移入小瓶进行UPLC-MS分析。所有尿液样本每等份取200μL被混合在一起作为“质量控制”（QC）样本。

3.方法验证

在测试样品之前，QC样品运行六次，以调节或平衡系统。方法的重复性是通过在一天内分析6份质量控制样品来评估的。通过在自动取样器（保持在4℃下）中放置6个制备的质量控制样品12小时，以及在单个批次中连续运行新制备的质量控制样品（n=6），测试样品的制备后稳定性。此外，在整个分析过程中，每10个试样插入一个质量控制样品，以评估分析的稳定性。

4.多变量数据分析与潜在生物标志物识别、统计分析

实验结果

1.血清生化检测

通过血清生化检测，高血脂模型饲喂高脂饲料10周后，血清TC、TG、LDL-c水平均显著升高，HDL-c水平无明显变化。AE治疗6周后，AE50和AE100组的TC水平比Mod组分别降低26.0%和34.3%（图1A）。AE50组和AE100组的LDL-c水平分别降低了37.0%和40.9%（图1C）。口服AE 6周后，50和100mg/kg AE组总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）均显著降低（P<0.05和P<0.001）。

图1 | AE对治疗6周后血脂水平的影响

2.组织病理学检测

通过摄影及H&E染色切片观察发现Con组肝组织细胞结构完整，肝细胞排列整齐，无明显脂肪滴和脂肪空泡堆积。相反，Mod组大鼠肝组织中有泡沫状脂肪滴堆积和严重的肝脂肪变性。AE100组肝组织内未见明显脂肪泡，肝细胞排列整齐完整，与Con组肝组织相似。AE50组肝脏结构有一定程度的恢复，但与Con组相比，肝内脂肪滴和空泡较少。

图2 |（A，E）Con组；（B，F）Mod组；（C，G）A E 50组；（D，H）A E 100组

3.代谢组分析结果

①方法验证结果

选择10个提取的离子色谱峰作为代表离子，覆盖不同的RT区，丰度不同，代表不同的化合物类别。利用PCA分析投影复杂数据，如图所示，正模式和负模式的QC样本在记分图中都具有很强的再现性，表明随着分析的进行，没有出现与径流相关的重大变化。

图3 | QC样本PCA图

②代谢谱的LC/MS分析及生物标志物鉴定

图4 | 代谢谱的LC/MS分析及生物标志物鉴定

在OPLS-DA评分图中观察到Con组和Mod组完全分离（图4A和B）。为了揭示导致Con组和Mod组之间差异最大的潜在生物标志物，采用质心标度法进行S图和方差分析。如图4C和D所示，偏离X轴和Y轴零点的点对Con组和Mod组的差异贡献最大。VIP值在1.5以上，P值在0.05以下的代谢物被认为是区分这两组的潜在生物标志物。选择了26种内源性代谢物作为尿液中潜在的生物标志物，其中23例由AE修复。

图5 | LC-MS代谢组学分析

分数散点3D图（A和B）显示Con组和Mod组明显分离。AE治疗组偏离Mod组，阳性和阴性离子模式均接近Con组，表明AE治疗后尿代谢模式恢复正常或接近正常水平。在分层聚类结果中观察到类似的变化趋势（E，F）；（C，D）柱状图显示Con，Mod，AE 50和AE 100组标记代谢物在正离子和负离子模式下的相对信号强度。

实验结论

HFD改变了尿样中的系统代谢谱，从而导致血清胆固醇和甘油三酯甚至肝组织中的显著变化。AE可使代谢谱恢复正常，血清生化和肝组织病理学的影响与尿代谢谱的影响一致。

小鹿推荐

本研究采用高脂饲料喂养建立高脂血症大鼠模型，采用LC-MS代谢组学方法评价AE的抗高脂血症作用。建立了一种基于UPLC-ESI-QTOFMS的尿代谢组学方法，结合单变量和多变量统计分析，以区分不同组的代谢谱，识别高脂血症的潜在生物标志物，以及AE的降脂机制。本研究首次从生化和组织病理学的角度探讨了AE对高脂血症大鼠的治疗作用及其作用机制，随后进行了尿代谢组学研究。结果表明，AE可通过多种相关途径恢复到正常水平，对高脂血症有良好的治疗作用，十分值得借鉴。

文献参考

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